Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике

.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англSDS PAGE

).

Содержание

Механизм разделения

Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов

.

SDS-PAGE по Лэммли

В 1970 году Лэммли (англLaemmli) для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы[1]. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд

.

При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений

:
  • белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
  • количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
  • собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.

В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев

.

Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англdiscontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6, 8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8, 5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6, 8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8, 8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода

.

В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе

.

Визуализация продуктов разделения

Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси (en:Coomassie blue) или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану

.

Интерпретация результатов

В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др

.

Определение молекулярной массы исследуемого белка с использованием SDS-PAGE по Лэммли

Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются, в случае если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80% длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R2> 0, 95). Т.е. для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка

.

Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0, 1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако, для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0, 1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что в свою очередь затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков

.

Буферные системы

Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris

.

См. также

Примечания

Литература


Wikimedia Foundation. 2010.

Look at other dictionaries:

  • Электрофорез в полиакриламидном геле — (сокр. электрофорез в ПААГ, ПААГ электрофорез; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)  метод молекулярной биологии и биохимии, используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на движении заряженных… …   Википедия

  • Электрофорез белков — У этого термина существуют и другие значения, см. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Электрофорез белков способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси …   Википедия

  • Электрофорез белков в ПААГ — Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel… …   Википедия

  • Электрофорез в пааг — Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)  метод молекулярной биологии, используемый исследователями для разделения белков и нуклеиновых кислот. В случае электрофореза белков… …   Википедия

  • Электрофорез по Леммли — Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel… …   Википедия

  • ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — (от электричество и греч. Phóorēsis — несение, перенесение), передвижение заряженных частиц под действием внешнего электрического поля к электроду, знак которого противоположен заряду частиц; метод анализа и препаративного разделения… …   Ветеринарный энциклопедический словарь

  • СДС полиакриламидный гель-электрофорез — * СДС поліакрыламідны гельэлектрафарэз * Sodium Dodecyl Sulfate PAGE or SDS PAGE метод разделения белков в полиакриламидном геле с использование анионного детергента СДС (содиумдодецилсульфат) …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • Вестерн блоттинг — Вестерн блот анализ белков, разделенных при помощи градиентного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.[1] Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blot)  аналитический метод, используемый для определения… …   Википедия

  • Вестерн-блот — Вестерн блоттинг (вестерн блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot)  аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для… …   Википедия

  • Лаурилсульфат натрия — Лаурилсульфат натрия …   Википедия

  • SDS-PAGE — Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)  метод молекулярной биологии, используемый исследователями для разделения белков и нуклеиновых кислот. В случае электрофореза белков… …   Википедия

  • SDS PAGE — Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)  метод молекулярной биологии, используемый исследователями для разделения белков и нуклеиновых кислот. В случае электрофореза белков… …   Википедия

  • Полиакриламидный гель — Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)  метод молекулярной биологии, используемый исследователями для разделения белков и нуклеиновых кислот. В случае электрофореза белков… …   Википедия

  • ДНК-маркер — Рис.1 Электрофорез ПЦР продуктов в агарозном геле и окрашенных бромистым этидием, полученных методом IRAP амплификации. Левая дорожка  ДНК известной длины (от 900 до 3000 пар нуклеотидов) …   Википедия

  • Секвенирование — биополимеров (белков и нуклеиновых кислот  ДНК и РНК)  определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от лат. sequentum  последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание… …   Википедия

Книги